（1）外顯子生物實(shí)驗(yàn)室提供： Pull down RNA探針標(biāo)記服務(wù)；價(jià)格：3500元，10-20T，備注：小于2000bp。
（2）提供：RNA標(biāo)記生物素，以便于開展Pull down實(shí)驗(yàn)。
（3）標(biāo)記原理：通過(guò)T3、T7轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)的RNA，然后，進(jìn)行3端標(biāo)記，將生物素標(biāo)記在RNA上；
（4）獲得的RNA探針，用于Pown down實(shí)驗(yàn)。
附說(shuō)明書：
磁珠法RNA-Protein Pull-Down 試劑盒（V5.3）
貨號(hào)：R5126 本試劑盒室溫運(yùn)輸，儲(chǔ)存于4°C
試劑盒成份：
（一）蛋白-RNA富集試劑盒（25T） R5126-1，儲(chǔ)存于4°C
（1）Streptavidin 磁珠：1mL, 10mg/mL；
（2）RNA捕獲溶液：10mL, 20mM Tris pH 7.5, 1M NaCl, 1mM EDTA
（3）20mM Tris, 5mL, pH 7.5
（4）蛋白-RNA結(jié)合溶液(10X)：1mL,0.2M Tris pH 7.5, 0.5M NaCl, 20mM MgCl2, 1% Tween-20
（5）洗液(1X), 10mL, 20mM Tris (pH 7.5), 10mM NaCl, 0.1% Tween-20
（6）Biotin Elution Buffer, 1.5mL
（7）50%無(wú)菌甘油, 0.5mL
（8）HuR Monoclonal Antibody, 50μL, For Western blots（10T）
（二）探針對(duì)照：R5126-2，儲(chǔ)存于-20°C
Positive AR RNA Probe：10μM， 25μL, 5Test。
5´-CUGGGCUUUUUUUUUCUCUUUCUCUCCUUUCUUUUUCUUCUUCCCUCCCUA-3´
Negative RNA (A)25 Probe： 25μL, 5Test。
試劑盒介紹：
磁珠法RNA-蛋白質(zhì)沉淀試劑盒，利用鏈霉親和素磁珠鏈接到生物素標(biāo)記的RNA，形成磁珠探針，生物素標(biāo)記的RNA探針與目的蛋白（RBP）結(jié)合。磁珠-親和素-生物素化RNA與蛋白形成復(fù)合物。通過(guò)磁珠分離出來(lái)。該試劑盒包括：各種緩沖液，標(biāo)記生物的陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照，適合下游檢測(cè)如蛋白質(zhì)印跡（WB）和質(zhì)譜（MS）。
對(duì)照原理：陽(yáng)性RNA對(duì)照系統(tǒng)：利用3'非翻譯區(qū)雄激素受體（AR）RNA，AR RNA的近端3´非翻譯區(qū)（UTR）包含HuR和Poly（C）結(jié)合蛋白（CP1和CP2）的UC富集區(qū)。這些RNA結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性，一般細(xì)胞都應(yīng)該呈現(xiàn)陽(yáng)性。陰性對(duì)照polyA25 RNA和哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解液mRNA不結(jié)合，也不包含HuR或poly（C）BP結(jié)合位點(diǎn)。
簡(jiǎn)略步驟
本試劑盒的蛋白的富集程序已經(jīng)過(guò)優(yōu)化，步驟原理下圖。首先將生物素標(biāo)記的RNA結(jié)合到磁珠上，以使生物素的RNA定向結(jié)合特異性蛋白質(zhì)。親和素的磁珠與生物素的RNA結(jié)合。將結(jié)合RNA的磁珠在蛋白質(zhì)-RNA結(jié)合緩沖液中平衡。通過(guò)添加適當(dāng)?shù)木彌_液，渦旋并在磁力架上分離，洗滌磁珠。接著使用SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫樣品，然后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。
注意事項(xiàng)-1：準(zhǔn)備工作
（1）制備目的RNA、純化，然后自行標(biāo)記生物素或直接聯(lián)系我們，外顯子生物提供RNA探針的制備和標(biāo)記，價(jià)格2800元40-50次；
（2）金屬浴或水浴鍋；
（3）氯仿：異戊醇（24：1）、無(wú)水乙醇；
（4）細(xì)胞裂解液，外顯子實(shí)驗(yàn)室可提供；
（5）洗脫緩沖液：SDS PAGE上樣緩沖液；
（6）含0.05％Tween-20洗滌劑的TBS-T溶液；
（7）1.5ml磁珠分離架，外顯子生物實(shí)驗(yàn)室有售，250元/個(gè)；
（8）蛋白質(zhì)印跡用的PVDF膜、HRP山羊抗小鼠IgG（H+L）、WB化學(xué)發(fā)光底物。
注意事項(xiàng)-2：實(shí)驗(yàn)過(guò)程
（1）生物素RNA作為探針是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。
（2）操作使用標(biāo)記的RNA時(shí)，請(qǐng)保持無(wú)核酸酶的環(huán)境。戴上手套，口罩防止RNA酶。
（3）不要冷凍或干燥鏈霉親和素磁珠，冷凍或干燥會(huì)導(dǎo)致珠粒聚集，失去活性。
（4）為了減少蛋白質(zhì)降解，在細(xì)胞裂解液制備中加入蛋白酶抑制劑。
（5）將SDS-PAGE還原樣品緩沖液中的磁珠煮沸時(shí)，沸騰使磁珠失去結(jié)合活性不能重復(fù)使用。
詳細(xì)步驟
第一步 親和素磁珠的準(zhǔn)備
（1）保持無(wú)核酸酶的條件，用0.1% DEPC溶液噴灑或擦拭清潔工作區(qū)域，戴手套，口罩；
（2）取出磁珠，旋轉(zhuǎn)10秒，將磁珠重懸，吸取100μl，然后轉(zhuǎn)移至無(wú)核酸酶的離心管內(nèi)。
（3）將試管放在磁力架上，磁珠自動(dòng)保留到試管側(cè)面。用200ul的0.1M NaOH，50mM
NaCl（無(wú)核酸酶）洗滌磁珠兩次。在100mM NaCl中洗滌一次，溶解平衡磁珠備用。
第二步 裂解細(xì)胞（同WB，注意裂解蛋白濃度）
（1）將細(xì)胞加入裂解液，確保細(xì)胞裂解物蛋白，濃度務(wù)必大于2.0mg / mL，方便在使用結(jié)合反應(yīng)緩沖液時(shí)，保證其影響不大。如果裂解物中鹽多，可以透析或者用鹽離子洗脫柱。
第三步.標(biāo)記的RNA與鏈霉親和素磁珠結(jié)合
（1）每50μL磁珠結(jié)合100pmol RNA左右，以下說(shuō)明使用50pmol RNA到50μL磁珠。
（2）試劑盒包括陽(yáng)性和陰性RNA對(duì)照。為確定用戶RNA蛋白結(jié)合的特異性，第一次請(qǐng)使用
陽(yáng)性，陰性對(duì)照。
（3）在1.5mL微量離心管中加入50μL的鏈霉親和素磁珠。放入磁力架中，磁珠靠在試管
的側(cè)面，丟棄上清液。
（4）用等體積的20mM Tris（pH 7.5）洗滌，渦旋重懸珠。重復(fù)步驟洗滌一次。
（5）于磁力架上，磁珠收集在試管側(cè)面，丟棄上清。加入50uL 1X RNA Capture Buffer。
（6）將50pmol的標(biāo)記RNA添加到珠子中，輕輕混合。室溫下攪拌孵育15-30分鐘。
第四步.RNA結(jié)合蛋白與RNA結(jié)合
（1）將試管放入磁力架中，使磁珠靠在試管的側(cè)面，丟棄上清液。用等體積的20mM Tris（pH 7.5）洗滌，渦旋重懸珠。
（2）重復(fù)步驟（1）。
（3）將試管放入磁力架中，磁珠靠在試管的側(cè)面，棄上清液。將10XRNA-蛋白質(zhì)結(jié)合緩沖液稀釋至1X（即1：9超純水稀釋）。將100μL 1X蛋白質(zhì)-RNA結(jié)合緩沖液添加到磁珠混合。
（4）準(zhǔn)備RNA-蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)的預(yù)混液：
10X蛋白質(zhì)-RNA結(jié)合緩沖液 10 5-20微升
50％甘油 30 0-50微升
其他鹽等（可變） X 體積
裂解液（蛋白質(zhì)濃度2mg / mL 1-30 20-200微克
無(wú)核酸酶的水 至100 至100μL
（5）將試管放入磁力架中，以將磁珠收集在側(cè)面，丟棄上清液。
（6）將100μL的預(yù)混液添加到結(jié)合RNA的磁珠中，通過(guò)移液器或輕輕渦旋混合。
（7）在4°C下攪拌或旋轉(zhuǎn)孵育60分鐘。
第五步. RNA結(jié)合蛋白復(fù)合物的洗滌和洗脫
（1）將試管放入磁力架中，使磁珠靠在試管的側(cè)面。將上清液轉(zhuǎn)移到試管中以備后用。
（2）用等體積的1X洗滌緩沖液（100μL）洗滌。
（3）再重復(fù)兩次步驟1和2。如果需要，請(qǐng)保存洗滌上清液以進(jìn)行分析。
（4）將試管放入磁力架中，使珠子靠在試管的側(cè)面。將上清液轉(zhuǎn)移到試管中以備后用。
（5）向珠中加入50μL洗脫緩沖液，并渦旋混合均勻。于37°C攪拌孵育15-30分鐘。
（6）將試管放入磁力架中，以將磁珠收集在試管側(cè)面。除去上清液用于下游分析。
（7）如果下游應(yīng)用是蛋白質(zhì)印跡，將原樣品緩沖液添加至樣品至1X。
（9）在95-100°C下加熱洗脫的樣品5-10分鐘。電泳凝膠上或在-20°C儲(chǔ)存直至使用。
（10）對(duì)于對(duì)照反應(yīng)，每泳道加30μL。
第六步.蛋白質(zhì)印跡分析
注意：細(xì)胞裂解物泳道作為對(duì)照，以驗(yàn)證蛋白質(zhì)印跡是否正常運(yùn)行。
1.通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。
2.在室溫下，將膜在含有5％牛血清白蛋白（BSA）的TBS-T中封閉1小時(shí)。
3.準(zhǔn)備在10mL含5％BSA的TBS-T中包含10μL抗HuR抗體（〜36kDa）的溶液。
4.在室溫下將膜在抗HuR抗體中孵育4小時(shí)，或在4°C過(guò)夜。
5.用TBS-T清洗膜5次，每次5分鐘。
6.將山羊抗小鼠IgG（H + L）（HRP共軛，1：20,000）稀釋到含有5％BSA的TBS-T中。
7.將膜在稀釋的山羊抗小鼠IgG中于室溫孵育1小時(shí)。
8.用TBS-T清洗膜5次，每次5分鐘。
9.將膜與化學(xué)發(fā)光底物在室溫下孵育（例如，SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物）。
10.立即將膠片暴露在X射線膠片或CCD相機(jī)上進(jìn)行適當(dāng)?shù)钠毓狻?/span>
