人源DNA殘留檢測試劑盒說明書
產(chǎn)品編號：006.9606 規(guī)格：100T
應(yīng)用范圍
本試劑盒基于高度敏感的Taqman探針法，設(shè)計(jì)針對人基因組中高度重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物及Taqman探針，可用于定量分析各種生物制品的中間品、半成品和成品中的人殘留DNA含量，可檢測出微量的DNA殘留（10fg/ul）。
試劑盒組成
|
名稱 |
規(guī)格 |
數(shù)量 |
儲存 |
|
Human qPCR Mix(2×) |
1ml |
1 |
-20℃ |
|
Human Primer and Probe Mix |
300ul |
1 |
-20℃ |
|
Nuclease-Free Water |
10ml |
1 |
-20℃ |
|
Human DNA Control(10ng/ul) |
50ul |
1 |
-20℃ |
保存條件及有效期
試劑盒在-20℃保存，有效期1年。
適用儀器
包括但不限于ABI系列、iCycler、Roche等基于Taqman技術(shù)原理設(shè)計(jì)的熒光檢測儀及相應(yīng)軟件。
操作說明
1.Human DNA Control定量參考品的稀釋及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
使用試劑盒提供的Nuclease-Free Water將Human DNA Control進(jìn)行梯度稀釋，稀釋濃度依次為1ng/ul、100pg/ul、10pg/ul、1pg/ul、100fg/ul、10fg/ul；
1） 將Human DNA Control置于冰上完全融化，渦旋混勻，低速離心10s；
2） 取6支干凈的1.5ml離心管，分別標(biāo)記Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5；
3） 標(biāo)記為Std0的管中加入90ul Nucelase-Free Water和10ul的Human DNA Control(10ng/ul)，渦旋混勻1min，此時Std0的濃度為1ng/ul，可置于-20℃保存，使用時避免反復(fù)凍融。
4） 在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5管中加入90ul的Nucelase-Free Wate，再進(jìn)行梯度稀釋，具體稀釋如下：
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稀釋管 |
稀釋比例 |
濃度（fg/ul） |
|
Std1 |
10ul Std0+90ul Nucelase-Free Wate，渦旋混勻1min |
100000 |
|
Std2 |
10ul Std1+90ul Nucelase-Free Wate，渦旋混勻1min |
10000 |
|
Std3 |
10ul Std2+90ul Nucelase-Free Wate，渦旋混勻1min |
1000 |
|
Std4 |
10ul Std3+90ul Nucelase-Free Wate，渦旋混勻1min |
100 |
|
Std5 |
10ul Std4+90ul Nucelase-Free Wate，渦旋混勻1min |
10 |
2.反應(yīng)體系
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組分 |
體積（ul） |
|
Human qPCR Mix(2×) |
10 |
|
Human Primer and Probe Mix |
3 |
|
DNA Template |
7 |
|
Total |
20 |
注：
a. 每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)配制Mix混合液總量：Mix混合液=（反應(yīng)孔數(shù)+2）×（10+3）ul(含有2孔的損失量)
b. 陰性對照孔：Nucelase-Free Wate，待測樣品孔：可做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定大致濃度范圍，如樣本濃度高于標(biāo)準(zhǔn)曲線最高檢測限，可用Nucelase-Free Wate進(jìn)行稀釋。
3.PCR擴(kuò)增(FAM通道)
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循環(huán)步驟 |
溫度 |
時間 |
循環(huán)數(shù) |
|
預(yù)變性 |
95℃ |
10min |
1 |
|
變性 |
95℃ |
15s |
50 |
|
退火 |
56℃ |
30s |
|
|
延伸（收集熒光） |
72℃ |
30s |
結(jié)果分析
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制；
以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度C的對數(shù)為X軸，Ct值為Y軸作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可使用Excel或ELISACalc軟件計(jì)算。
示例：
各標(biāo)準(zhǔn)品濃度對應(yīng)的Ct值如下：
|
濃度（fg/ul） |
10 |
100 |
1000 |
10000 |
100000 |
|
Ct |
29.18 |
24.98 |
21.77 |
18.20 |
14.95 |
以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度C的對數(shù)lg(C)為X軸，Ct值為Y軸
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Lg(C) |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
Ct |
29.18 |
24.98 |
21.77 |
18.20 |
14.95 |
制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程y=ax+b，R2
2. 待測樣品濃度計(jì)算：
將待測樣品濃度的Ct均值帶入方程中，計(jì)算：
X（待測）值=（Ct(待測)-b）/a;
然后根據(jù)X值計(jì)算待測樣品的濃度：
C（待測）=10^( X（待測）)×稀釋倍數(shù)pg/ul
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